نتيجه اين مطالعه نشان داده که ارقام هاشم و FLIP90-131C،FLIP97-261C مقاومت خوبي نسبت به اين بيماري داشتند (شکري و اقدسي، 1392).
در يک بررسي در هند 239 رقم که طيف وسيعي از تنوع ژرم پلاسم بين ايران و هند بودند در شرايط مزرعه به مدت چند سال مورد ارزيابي قرار گرفتند نتايج نشان دادند که بيشترين مقاومت توسط ارقام هندي مانندP- 597، P- 621، P- 3649، P- 4128 و P- 4245 مشاهده شد (Govil & Rana, 1984).
در يک بررسي مقاومت 31 لاين نخود نسبت به بيماري زردي و پژمردگي نخود در گلخانه ارزيابي کردند نتايج اين تحقيق نشان داده که 3 لاين، 99109، 99112 و 99115 بسيار مقاوم، 2 لاين، 1040/99 و 99104 نيمه مقاوم و 26 لاين ديگر بسيار حساس بودند (Sibtain, et al., 2001).
در پژوهشي که در هند صورت گرفته مقاومت 32 رقم نسبت به بيماري زردي و پژمردگي ارزيابي کردند که ارقام،Phule G- 00108 ،Phule G- 00109 ،Phule G- 94259 ،Phule G- 96006 ،PDG-84-16 ، G97030 مقاوم و ارقام Phule G- 00110،Phule G-94091 ،H-82-2 ،IPCK-256 ، IPC-2001-02،HOO-216 ، HR-00-299 نيمه مقاوم گزارش کردند (Haseed et al., 2006).
در پژوهشي در پاکستان 145 ژنوتيپ نخود نسبت به بيماري زردي و پژمردگي مورد ارزيابي قرار گرفتند که 14 ژنوتيپ، 90395،C-235 ،C-44 CM2000،ILC 182 ،FLIP97-129C ،FLIP97-172C ،FLIP98-107C ،FLIP98-227C ،FLIP98-230C FLIP98-231C،FLIP98-38C ،FLIP98-54C ،ILC7374 ، KC-89 مقاوم، 65 ژنوتيپ، متحمل و 66 ژنوتيپ در مرحله گياهچه حساس گزارش شدند. در مرحله توليدمثل هيچ ژنوتيپ مقاومي مشاهده نشده است (Iqbal et al., 2010).
در تحقيقي که در پاکستان صورت گرفته ارقام CM-98 ،Aug-786 ،Bittal-98 ،Balksar-2000 Wanhar-2000 و Punjab-2000مقاوم گزارش کردند (Mahmood et al., 2011).
نتايج يک پژوهش در الجزاير نشان داد که از بين 13 لاين نخود مورد ارزيابي 6 لاين، (P503, F97-555, 93-93, 15-24 COL, ILC1929 , PPC25) حساس به پاتوتيپ پژمردگي، دو لاين، ILC482 و INRA199 نيمه حساس و تنها لاين، 4107 مقاوم به بيماري زردي و پژمردگي بود (Haddad et al., 2014).

فصل دوم
مواد و روش‌ها
(Material and Methods)

2-1- جمع آوري نمونه
در اين بررسي طي سال زراعي 93-1392 از شهرستان‌هاي مختلف استان، بروجرد، خرم‌آباد، پلدختر، نورآباد، الشتر، زاغه، دورود، کوهدشت و اليگودرز بازديد بعمل آمد. بدين منظور از هر شهرستان، سه يا چهار مزرعه به طور تصادفي انتخاب شد و نمونه‌هاي آلوده و مشکوک به پژمردگي و زردي جمع‌آوري و با ذکر مشخصات داخل کيسه فريزر قرار داده شد و به آزمايشگاه منتقل شد.
2-2- محيط کشت ها
2-2-1- محيط کشت سيب زميني- دکستروز-آگار (PDA)
از اين محيط کشت به دو صورت استفاده شد.
1- محيط کشت آماده تجاري که طبق دستورالعمل شرکت سازنده آماده و استفاده شد.
2- محيط کشت دست ساز که به صورت زير آماده و استفاده گرديد. رشد فوزاريوم و ايجاد رنگيزه براي بررسي هاي مورفولوژيکي روي اين محيط بهتر از محيط آماده است.
سيب زميني پوست کنده يا پوست کنده نشده 250-200 گرم
دکستروز 15 گرم
آگار-آگار 20 گرم
براي تهيه آن عصاره 250-200 گرم سيب زميني پوست کنده يا پوست نکنده را گرفته و 15 گرم دکستروز، 20 گرم آگار در دماي 121 درجه سانتي‌گراد به مدت 30 دقيقه سترون گرديد. از اين محيط کشت عمدتاً براي جداسازي، تعيين نرخ رشد، نحوه رشد و تعيين رنگ پرگنه استفاده شد.
2-2-2- محيط کشت آب- آگار (WA)
براي تهيه اين محيط کشت 20 گرم آگار به يک ليتر آب مقطر اضافه شد. و در فشار 15 پوند و در دماي 121 درجه سانتي‌گراد به مدت 30 دقيقه سترون گرديد. از اين محيط کشت براي خالص سازي قارچها (تک اسپور کردن و نوک ريسه کردن) استفاده شد.
2-2-3- محيط کشتSNA (Synthetic Nutrient-poor Agar)
براي تهيه محيط کشت فوق طبق روش نيرنبرگ (Nirenberg, 1981, 1998) ترکيبات زير را به يک ليتر آب مقطر اضافه کرده و مشابه محيط آب -آگار سترون شد.
KH2 Po4 1 گرم
KNo3 1 گرم
MgSo4,7 H2O 5/0 گرم
KCl 5/0 گرم
گلوکز 2/0 گرم
ساکاروز 2/0 گرم
آگار- آگار 20 گرم
آب مقطر 1000 ميلي ليتر
اين محيط براي تحريک قارچها به اسپوردهي، توليد ميکروکنيديوم، توليد ماکروکنيديوم تيپيک در گروه گونه‌اي (species complex) مشاهده زنجير ميکروکنيديوم در برخي از گونه‌هاي بخش ليزيولا، توليد کلاميدوسپور و نيز مشاهده فياليد بسيار مناسب است.
2-2-4- محيط کشت Nash & Snyder
براي تهيه اين محيط کشت ترکيبات زير به يک ليتر آب مقطر سترون اضافه شد و مانند محيط کشت آب -آگار سترون گرديد. و مطابق آنچه در منابع ذکر شده است عمل گرديد (Burgess et al., 1994).
آگار 20 گرم
پپتون 15 گرم
KH2 Po4 1 گرم
MgSo4, 7 H2O 5/0 گرم
پنتا کلرو نيترو بنزن 1 گرم
پس از اينکه دماي محيط کشت ذکر شده به 55 درجه سانتي گراد رسيد آنتي بيوتيکهاي زير به آن اضافه شد.
سولفات استرپتومايسين 1 گرم
سولفات نئومايسين 12/0 گرم
اين محيط کشت براي جداسازي فوزاريومها از اندامهاي گياهي بسيار مناسب بوده و اختصاصي عمل مي‌کند بعد از مدتي اين محيط کشت حالت سمي پيدا مي‌کند و همچنين مرفولوژي کنيديها غير‌طبيعي خواهد شد بنابراين براي تشخيص گونه‌ها مناسب نبوده و بايستي پس از رشد قارچ آن را به محيط کشت PDA منتقل نمود (Burgess et al., 1994).
2-2-5- محيط کشت برگ ميخک- آگار (CLA)
براي تهيه اين محيط کشت از برگهاي ميخک (Dianthus caryophillus L.) تازه و عاري از باقيمانده سموم قارچکش استفاده شد (Nelson et al., 1983). برگهاي مورد استفاده ابتدا در مسير جريان آّب کاملاً شسته شد و پس از خشک شدن به قطعات يک سانتي‌متري در آورده و در داخل يک تشتک پتري 15 سانتي‌متري در دماي حدود 60 درجه سانتي‌گراد آون قرار داده تا کاملاً خشک شد. سپس درب تشتک پتري را بسته و در قطعاتي از فويل آلومينيوم پيچيده و در فشار 15 پوند و دماي 121 درجه سانتي‌گراد اتوکلاو گرديد. ميتوان قطعات برگ خشک شده را در داخل پليت هاي يکبار مصرف قرار داده و با اشعه گاما سترون کرد. بعد از تهيه محيط کشت آب-آگار (مانند آنچه در بند 2-2-2 ذکر گرديد) در وسط تشتک پتري يک يا دو قطعه برگ ميخک سترون قرار داده شد و سپس يک قطعه از محيط کشت حاوي قارچ در مجاورت برگ ميخک قرار داده شد. پس از 24 ساعت نگهداري در انکوباتور زير نور NUV (Near ultra violet) قرار داده شد. از مزاياي اين محيط کشت تسريع اسپورزايي، تشکيل کنيديوم هاي تيپيک (يک ويژگي لازم براي تشخيص فوزاريوم ها) توليد زنجير ميکرو کنيديوم، سرهاي دروغين (false heads)، اسپوردوخيوم، پيونت، پلي فياليد و منوفياليد و تشکيل پريتسيوم (برگهاي مسن براي تشکيل فرم جنسي مناسب ترند) است. محيط کشت CLA يک محيط نيمه طبيعي بوده و شرايط طبيعي را براي قارچ فراهم مي‌سازد و از آنجائيکه اين محيط کشت از نظر مقدار کربوهيدرات فقير مي‌باشد. لذا قارچ بطور پراکنده رشد کرده و مشاهده برخي از ويژگي‌هاي تاکسونوميک را بهتر فراهم مي‌سازد.
2-2-6- محيط خاک
براي تهيه اين محيط کشت مطابق روش بوث (Booth, 1971) مقدار چند گرم خاک لوم شني در شيشه هاي مک کانتي ريخته بطوريکه يک سوم حجم شيشه از خاک پر شده و سپس سترون گرديد. از اين محيط براي نگهداري گونه‌هاي قارچ فوزاريوم در دماي اتاق به مدت سه سال مي‌توان استفاده نمود و چنانچه محيط کشت در دماي پنج درجه سانتي‌گراد يخچال نگهداري شود تا هشت سال نيز قابل نگهداري است.
2-2- 7- محيط PDB
براي تهيه اين محيط کشت ترکيبات زير به يک ليتر آب مقطر سترون اضافه شد و مانند محيط کشت آب -آگار سترون گرديد. اين محيط کشت مايع است و از اين محيط کشت عمدتاً براي تهيه سوسپانسيون قارچ استفاده شد.
سيب زميني 200 گرم
دکستروز 20 گرم
آب مقطر 1000 ميلي ليتر
2-3- روش جداسازي قارچها
براي جداسازي قارچها از اندام هاي گياهي، عمدتاً از محيط کشت هاي PDA‌ و Nash & Snyder استفاده شد.
2-3-1- استفاده از محيط کشت PDA‌
براي کشت اندام هاي گياهي روي اين محيط ابتدا اندام‌هاي گياهي با آب معمولي شسته و قطعات کوچکي 5-3 ميلي‌متري از قسمتهاي مختلف ساقه، ريشه و طوقه تهيه شد وسپس با محلول هيپوکلريت سديم 5/ درصد به مدت 3-1 دقيقه سترون و سه مرتبه با آب مقطر شسته شد. سپس با قرار دادن قطعات بر روي کاغذ صافي خشک، و در هر تشتک پتري 4-3 قطعه از آنها قرار داده و در دماي ?25 نگهداري شدند و پس از رشد قارچ از حاشيه جوان پرگنه قارچ زيرکشت‌هايي تهيه و قارچ جداسازي گرديد.
2-3-2- استفاده از محيط کشتNash & Snyder
اين محيط کشت براي جداسازي فوزاريوم‌ها بسيار مناسب و اختصاصي است. براي کشت بافت روي اين محيط نيازي به ضدعفوني سطحي بافت نيست و فقط بافت مورد نظر را با آب مقطر سترون کاملاً شستشو داده و پس از خشک کردن توسط کاغذ صافي سترون در شرايط سترون روي اين محيط کشت داده شد.
2-4- روش خالص سازي قارچها
2-4-1- روش تک اسپور کردن (single sporing)
در اين پژوهش از روش تک اسپور کردن به طريقه مخطط کردن روي محيط کشت آب- آگار استفاده شد. براي اين منظور ابتدا قارچ روي محيط کشت CLA زير نور NUV (near ultra violet) قرار داده شد و در لوله‌هاي آزمايش 50×15 مقدار3-2 ميلي ليتر آّب مقطر سترون گرديد. سپس در هر تشتک پتري حدود 9 ميلي متر از محيط کشت آب – آگار ريخته شد تا لايه نازک يکنواختي تشکيل دهد. پس از توليد اسپور روي محيط CLA (بويژه اسپوردوخيوم) با استفاده از لوپ قارچ شناسي يک لوپ اسپور برداشته شد و در داخل لوله حاوي آب مقطر استريل سوسپانسيون اسپور تهيه گرديد واز سوسپانسيون اسپور يک لوپ برداشته و روي لام قرار داده و لامل روي آن گذاشته شد و زير ميکروسکوپ با عدسي X 10 مشاهده گرديد. چنانچه زير ميکروسکوپ 10-1 اسپور وجود داشته باشد براي تک اسپور کردن مناسب است. و در صورتيکه تعداد اسپورها بيشتر بود آن را رقيق کرده و اگر تعداد اسپورها کمتر باشد ميتوان براي به دست آوردن غلظت مناسب مقدار بيشتري از مايه قارچ برداشت. سپس يک لوپ از سوسپانسيون همگن برداشته و روي سطح محيط آب- آگار و بصورت خطوط موازي از بالا به پايين تشتک کشيده شد (اين خطوط امکان بررسي اسپورها و صرفه جويي در تک اسپور کردن قارچها را فراهم مي سازد). واضح است که خطوط ابتدايي تراکم بيشتر و خطوط انتهايي تراکم کمتري خواهند داشت. پس از 18-16 ساعت تشتک ها به صورت وارونه زير ميکروسکوپ يا بينوکولر بررسي شد. دور اسپورهاي جوانه زده که از ساير اسپورها فاصله بيشتري دارند با استفاده از يک مازيک نوک باريک (ماژيک CD) خط کشيده و مشخص شد. سپس قطعات کوچکي از محيط که در داخل خطوط محصور شده و حاوي اسپور جوانه زده بود برداشته و روي محيط PDA قرار داده شد.با توجه به رنگ و نحوه رشد پرگنه براي تشخيص نگهداري گرديد. روش‌هاي متعدد ديگري نيز براي تک اسپور کردن قارچها وجود دارد که ساير محققين از آن استفاده مي‌کنند (Nelson et al., 1983).
2-5- روش نگهداري کشت خالص قارچها
براي استفاده از گونه‌هاي فوزاريوم و نگهداري در کوتاه مدت و يا دراز مدت و نيز جلوگيري از تغييرات ژنتيکي (موتاسيون)، آلودگي‌هاي باکتريايي و جلوگيري از ورود کنه‌ها و نماتدها به محيط‌هاي قارچي، لازم است از محيط‌هاي مناسب و شرايط نگهداري مطلوب استفاده گردد. بدين منظور از محيط کشت PDA و SNA استفاده شد. در داخل لوله‌هاي آزمايش حدود 10 ميلي ليتر از اين

دسته بندی : No category

دیدگاهتان را بنویسید