محيط کشت ريخته شد و درب آن توسط پنبه بسته و روي آن با فويل آلومينيوم پوشانده شد و مانند ساير محيط‌هاي کشت سترون گرديد. پس از سترون شدن، لوله‌ها را از اتوکلاو خارج کرده و روي يک سطح شيب‌دار با زاويه 45 درجه قرار داده تا محيط به صورت مورب درآيد. پس از سرد شدن محيط کشت (بعد 24 ساعت) يک قطعه از محيط کشت قارچ مورد نظر را روي آن قرار داده و در دماي 25-22 درجه سانتي‌گراد داخل انکوباتور قرار داده شد تا قارچ رشد کند سپس براي جلوگيري از آلودگيهاي احتمالي پنبه‌ي سر لوله‌ها سوزانده و توسط پارافيلم بسته شد (بوي سوختگي پنبه براي کنه‌ها خاصيت دور کنندگي دارد) و جهت شناسايي نگهداري شد. به منظور کاهش رشد و فعاليت قارچ لوله‌ها در دماي 8 درجه سانتي‌گراد يخچال گذاشته شد. محيط SNA به دليل ضعيف بودن (از نظر قند) تغييرات ژنتيکي را به حداقل مي‌رساند. در حاليکه محيط‌هاي قوي از نظر قند (نظير PDA) اين تغييرات را افزايش مي‌دهند. با استفاده از اين محيط کشت مي‌توان فوزاريوم ها را به مدت يک سال نگهداري نمود. در اين تحقيق 60 جدايه فوزاريوم جدا شد. پس از خالص سازي، از هر جدايه دو لوله SNA و دو لوله PDA نگهداري گرديد.
2-5-1 روش استفاده از محيط خاک
در اين روش مطابق روش بوث (Booth, 1971) مقدار چند گرم خاک لوم شني در شيشه‌هاي مک کانتي ريخته بطوريکه يک سوم حجم شيشه از خاک پر شد و سپس سترون گرديد. پس از سترون کردن و سرد کردن خاک يک قطعه از محيط کشت حاوي ميسليوم قارچ و يا سوسپانسيون قارچ به محيط اضافه کرده و در دماي 5 درجه سانتي‌گراد يخچال و يا 8 درجه سانتي‌گراد سرد خانه نگهداري شد. نگهداري محيط در دماي پايين قدرت پايداري و نگهداري قارچ را افزايش مي‌دهد (Burgess et al., 1994).
2-6- روش وادارسازي قارچها به اسپورزايي
برخي از قارچها از جمله فوزاريوم‌ها روي محيط‌هاي کشت نظير PDA فقط رشد رويشي داشته و بندرت توليد اسپور مي‌کنند و چنانچه توليد اسپور نمايند اسپورهاي تيپيک و کليدي توليد نمي‌کنند بطوري که شناسايي قارچ بر اساس آنها ممکن نيست. براي وادار کردن اين جدايه‌ها به توليد اسپورهاي تيپيک و زنجير کنيديوم جهت شناسايي گونه از محيط‌هاي کشت SNA و CLA استفاده شد.
2-6-1- روش استفاده از محيط CLA
محيط کشت CLA (برگ ميخک – آگار) محيط کشتي ضعيف (از نظر قند) و تقريباً طبيعي است. در حاليکه محيطي تقريباً طبيعي را براي قارچ فراهم مي‌سازد، رشد رويشي قارچ را کاهش داده و آن را وادار به رشد زايشي و توليد اسپورهاي تيپيک و کليدي و تشکيل اسپوردوخيوم و پيونت مي‌کند. براي وادارسازي بيشتر جدايه‌ها به توليد اسپورهاي تيپيک يک قطعه از محيط کشت به همراه ميسليوم قارچ در کنار برگ هاي ميخک روي اين محيط قرار داده شد و پس از 24 ساعت انکوباتور در دماي 25-22 درجه سانتي‌گراد، زير نور NUV با فاصله 45-40 سانتي‌متري و دوره نوري 12 ساعت روشنايي و 12 ساعت تاريکي گذاشته و پس از يک هفته تا 14 روز اکثر جدايه ها روي اين محيط توليد اسپور تيپيک مي‌کنند. برخي از قارچهاي فوزاريوم نيز روي CLA بندرت اسپور مي‌دهند که در اينصورت از محيط کشت SNA استفاده مي‌شود که در اين تحقيق بيشتر از محيط کشت CLA استفاده شد.
2-7- روش وادارسازي قارچها به توليد کلاميدوسپور
توليد يا عدم توليد کلاميدوسپور در شناسايي گونه‌هاي فوزاريوم به عنوان يک معيار کليدي در تشخيص بکار مي‌رود و از آنجائيکه بعضي جدايه‌هاي فوزاريوم بندرت و پس از مدت زمان طولا‌ني کلاميدسپور توليد مي‌کنند براي تسريع در توليد کلاميدسپور از روشهاي مختلف مي‌توان استفاده نمود در اين تحقيق قطعه‌اي از محيط کشت PDA به همراه ميسيليوم قارچ در داخل تشتک پتري حاوي آب مقطر سترون قرار داده شد. پس از نگهداري در شرايط خنک (5-4 درجه سانتي گراد) يخچال پس از حدود يک هفته در اکثر جدايه‌هايي که کلاميدوسپورتوليد مي کنند، کلاميدوسپور توليد گرديد (Nelson et al., 1983).
2-8- نحوه تشخيص قارچها
در اين پژوهش تشخيص عوامل قارچي غير فوزاريومي بر اساس کليدهاي الايز (Ellis, 1971)؛ بارنت و هانتر (Barnet & Hunter, 1972)؛ سيوانسان (Sivanesan, 1987) ؛ سيمونز (Simons, 2004) انجام شد. تشخيص کليه جدايه‌هاي فوزاريوم بر اساس ويژگي‌هاي ظاهري آنها انجام شد هر يک از اين ويژگي‌ها به عنوان يک معيار تشخيص براي گونه‌هاي فوزاريوم مورد استفاده قرار مي‌گيرند. اين ويژگي ها شامل: نحوه رشد پر

دسته بندی : No category

دیدگاهتان را بنویسید